肺腺癌对铂类耐药是影响预后的主要问题,Keap1/Nrf2/ARE 信号通路在铂类耐药中发挥重要作用[1]。在活性氧的刺激下,转录因子 Nrf2[2]与 Keap1 解偶联,Nrf2 入核结合于肌腱纤维瘤蛋白(sMaf)形成异二聚体后启动 ARE 靶基因转录[3],启动超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧化酶-1(HO-1)、谷胱甘肽转移酶(GSH)等 Ⅱ 相解毒酶[4]转录,提高细胞抗氧化应激能力[5],增强肿瘤细胞的代谢活动和生长,促进肿瘤增殖[6];导致癌细胞凋亡减少,使肿瘤耐药作用加强[7-9],多药耐药相关蛋白 1(MRP-1)在多药耐药性(MDR)中发挥了非常重要的作用[10-11],MRPs 常与 Ⅱ 相解毒酶表达的调控具有协同作用[12-14]。Nrf2 活性受 MAPKs 信号通路的调控[15-16],但 MAPKs 直接磷酸化 Nrf2,并不引起显著的 Nrf2 激活,且因不同肿瘤细胞而不同,Nrf2 活化入核与磷酸化的 ERK、JNK、p38 形成二聚体,再激活 Nrf2 下游基因的转录[17];不同机体脏器部位 Nrf2 基因激活的途径亦不同[18]。二甲双胍能降低糖尿病患者合并卵巢癌、肺癌、肝癌等肿瘤风险[19-20];可通过调控细胞周期蛋白及其相关因子的表达,阻滞不同肿瘤细胞于细胞 G 0/G 1 期或 G 1/S 期[21-23];亦可抑制不同病理类型的肺癌细胞增殖[24],并呈剂量依赖性,仅在小细胞癌细胞系中具有诱导细胞凋亡的作用。目前国内外对二甲双胍影响耐铂类肺腺癌细胞中 Nrf2 基因表达的机制鲜有报道。本研究观察 Nrf2/ARE 信号通路在肺腺癌铂类耐药表达中的作用,旨在源头上寻找多药耐药过程中的关键基因,为肿瘤的临床精准化疗提供理论依据和治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株及试剂 人肺腺癌细胞株 A549、耐顺铂(DDP)肺腺癌细胞株 A549/DDP(中国科学院上海生命科学院细胞库);RPMI1640 干粉培养基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS)为 Hyclon 产品(上海鲁汶生物工程);RNA 反转录采用 PrimeScript RTreagent Kit RR047A 试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒采用 SYBR PrimeScript(Perfect Real Time)RR086A 试剂盒(大连 TakaRa 公司),二甲双胍(上海生工生物工程股份有限公司);所用引物(表 1;上海博彩生物科技有限公司)。

1.1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞培养于 10% FBS RPMI1640 中,含青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml),在 5% CO 2、37 ℃ 饱和湿度的培养箱内培养。
1.2 方法
1.2.1 基因表达检测 A549 和 A549/DDP 细胞接种于 6 孔板中,以 1×105/孔的密度培养 24 h 后收集细胞,根据说明书推荐的方法用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA,再转录成 cDNA,用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行定量多聚酶链反应,在 95 ℃,1 min,1 个循环;95 ℃,5 s,40 个循环;60 ℃,30 s,40 个循环的条件下对反应液进行 Real-time PCR 扩增(Bio-Rad CFX96 荧光定量 PCR 仪,美国),测定 A549 和 A549/DDP 细胞间 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因表达水平;不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)刺激细胞 4 h 后,分别提取两株细胞 RNA 检测 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平变化。
1.2.2 Western blot 实验 A549、A549/DDP 细胞培养后抽提总蛋白,BCA 法测定总蛋白浓度,配胶后进行 SDS-PAGE 电泳,转膜并封闭,分别于 4 ℃ 孵育不同抗体和内参抗体过夜,TBST 分别洗涤膜 3 次后再孵育相应的二抗后,再用 TBST 洗涤膜 3 次,将 PVDF 膜正面向上铺于成像仪,用 Bio-Rad ChemiDoc MP 凝胶成像分析系统成像显影,蛋白谱带强度使用 ImageJ 软件分析。
1.2.3 细胞增殖实验(CCK-8)及凋亡检测 分别制备 A549 细胞和 A549/DDP 细胞悬液后接种 96 孔板,细胞密度为 1×104/孔,予二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)共培养 24 h,48 h 和 72 h 后,每孔加入 10 µl CCK8 孵育 4 h,用 flexstation 3 酶标仪(美国加利福尼亚 Molecular Devices 公司)在 450 nm 波长处测量并记录每孔中的吸光度;分别将 A549、A549/DDP 细胞接种于 24 孔板中,细胞密度为 5×104/ml,经不同浓度二甲双胍作用 24 h 或 48 h 后,胰酶消化收集细胞,重悬于 binding buffer 中,加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl propidium iodide(PI),室温避光 20 min,上机用流式细胞仪 BD FACSAriaTM II flow cytometer(美国加利福尼亚 BD biosciences 公司)检测细胞凋亡率。
1.3 统计学方法
数据均用均数±标准差( )表示,所得实验数据采用 SPSS 13.0 统计软件包进行数据处理。两样本均数之间的比较采用 t 检验,多个样本均数之间的比较采用单因素方差分析,计量资料使用 χ2 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A549 与 A549/DDP 细胞株间各耐药基因的基因和蛋白表达差异
经 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因水平筛选,对 A549 与 A549/DDP 细胞株进行基因表达检测,结果显示 A549 与 A549/DDP 细胞株的 Nrf2、MRP-1、GST 在基因水平的表达有明显差异,且在 A549/DDP 细胞株中的表达水平比 A549 显著增高(图 1a、1b、1c)。通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证,发现结果与基因水平筛选一致(图 1d)。以上结果提示,Nrf2、MRP-1、GST 在肺腺癌 DDP 耐药细胞株中的表达水平比敏感株显著增高。

2.2 不同浓度二甲双胍对 A549、A549/DDP 细胞增殖抑制及凋亡的影响
对 A549 与 A549/DDP 细胞株均予以不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)刺激,进行细胞增殖实验及凋亡检测,结果见图 2。随着二甲双胍浓度增高,A549 细胞增殖能力逐步减弱,尤其浓度为 5 mmol/L和 10 mmol/L 时,增殖能力明显减弱(图 2a);当二甲双胍浓度为 10 mmol/L 时,A549/DDP 细胞增殖能力明显减弱(图 2b)。且当二甲双胍浓度为 5 mmol/L 和 10 mmol/L 时,A549 细胞 48 h 后凋亡率(图 2e)较 24 h 凋亡率(图 2c)明显升高,但相同条件下 A549/DDP 细胞(图 2d、2f)凋亡率在 48 h 时较 24 h 仅轻度升高(均 P<0.05),提示二甲双胍诱导耐药细胞的凋亡率明显低于非耐药细胞,且作用的最佳时间点是 48 h。

2.3 二甲双胍刺激后各下游基因的变化
为了进一步明确二甲双胍刺激后各耐药基因的变化情况,用不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)刺激 A549 和 A549/DDP 细胞株,4 h 后提取 RNA 检测各基因水平变化,并通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证,发现随着二甲双胍浓度增高,A549 细胞(图 3)和 A549/DDP 细胞株(图 4)的 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平和蛋白水平的表达均逐步降低,提示二甲双胍能够明显抑制各耐药基因的表达。

3 讨论
本研究发现人肺腺癌 A549、A549/DDP 细胞 Nrf2 及下游抗氧化基因 GST、MRP-1 蛋白水平比较,差异存在统计学意义(P均<0.01)。Nrf2 可以在 Nrf2 诱导剂刺激下,通过与 MRP-2 基因明确的 ARE 位点结合,提高 MRP-2 的表达[25]。而 MRP-1 可以将 GSH 与抗癌药物形成 GSH 复合物泵出胞外[26-28],阻碍细胞内抗癌药物与靶位点结合降低细胞内抗癌药物浓度,致肿瘤细胞产生耐药性[29-30]。下调耐 DDP 的人肺腺癌细胞的 MRP 表达后,其对 DDP 的耐药性显著降低[31]。GSH 可能促进 DNA 的修复低[29],并可与铂或铂-DNA 络合物结合,降低顺铂的毒性,促进肿瘤细胞解毒。应用 GST 抑制剂可以增强 DDP 对耐药细胞株的细胞毒作用[32]。GSTs 属于 Ⅱ 相共轭酶,它们能将有活性的亲电子代谢产物解毒,它们的效应依赖于谷胱甘肽的水平,后者取决于 GCL 和 GSH 合酶[33]。
二甲双胍可能主要通过抑制线粒体呼吸链复合物 Ⅰ,小分子干扰 RNA 抑制 AMPK 的表达后,可逆转二甲双胍的抗肿瘤增殖作用[34-35]。本研究发现,二甲双胍能抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖,促进其凋亡,并呈时间和浓度依赖性,但对 A549/DDP 细胞,仅在高浓度二甲双胍时方能显示其对细胞增殖的抑制作用。经二甲双胍刺激,A549、A549/DDP 细胞 GST、Mrp-1、Nrf2 基因的 mRNA、蛋白水平表达存在显著差异(均P<0.05),我们研究进一步印证了二甲双胍的抗肿瘤效应。
肺腺癌对铂类耐药是影响预后的主要问题,Keap1/Nrf2/ARE 信号通路在铂类耐药中发挥重要作用[1]。在活性氧的刺激下,转录因子 Nrf2[2]与 Keap1 解偶联,Nrf2 入核结合于肌腱纤维瘤蛋白(sMaf)形成异二聚体后启动 ARE 靶基因转录[3],启动超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧化酶-1(HO-1)、谷胱甘肽转移酶(GSH)等 Ⅱ 相解毒酶[4]转录,提高细胞抗氧化应激能力[5],增强肿瘤细胞的代谢活动和生长,促进肿瘤增殖[6];导致癌细胞凋亡减少,使肿瘤耐药作用加强[7-9],多药耐药相关蛋白 1(MRP-1)在多药耐药性(MDR)中发挥了非常重要的作用[10-11],MRPs 常与 Ⅱ 相解毒酶表达的调控具有协同作用[12-14]。Nrf2 活性受 MAPKs 信号通路的调控[15-16],但 MAPKs 直接磷酸化 Nrf2,并不引起显著的 Nrf2 激活,且因不同肿瘤细胞而不同,Nrf2 活化入核与磷酸化的 ERK、JNK、p38 形成二聚体,再激活 Nrf2 下游基因的转录[17];不同机体脏器部位 Nrf2 基因激活的途径亦不同[18]。二甲双胍能降低糖尿病患者合并卵巢癌、肺癌、肝癌等肿瘤风险[19-20];可通过调控细胞周期蛋白及其相关因子的表达,阻滞不同肿瘤细胞于细胞 G 0/G 1 期或 G 1/S 期[21-23];亦可抑制不同病理类型的肺癌细胞增殖[24],并呈剂量依赖性,仅在小细胞癌细胞系中具有诱导细胞凋亡的作用。目前国内外对二甲双胍影响耐铂类肺腺癌细胞中 Nrf2 基因表达的机制鲜有报道。本研究观察 Nrf2/ARE 信号通路在肺腺癌铂类耐药表达中的作用,旨在源头上寻找多药耐药过程中的关键基因,为肿瘤的临床精准化疗提供理论依据和治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株及试剂 人肺腺癌细胞株 A549、耐顺铂(DDP)肺腺癌细胞株 A549/DDP(中国科学院上海生命科学院细胞库);RPMI1640 干粉培养基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS)为 Hyclon 产品(上海鲁汶生物工程);RNA 反转录采用 PrimeScript RTreagent Kit RR047A 试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒采用 SYBR PrimeScript(Perfect Real Time)RR086A 试剂盒(大连 TakaRa 公司),二甲双胍(上海生工生物工程股份有限公司);所用引物(表 1;上海博彩生物科技有限公司)。

1.1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞培养于 10% FBS RPMI1640 中,含青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml),在 5% CO 2、37 ℃ 饱和湿度的培养箱内培养。
1.2 方法
1.2.1 基因表达检测 A549 和 A549/DDP 细胞接种于 6 孔板中,以 1×105/孔的密度培养 24 h 后收集细胞,根据说明书推荐的方法用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA,再转录成 cDNA,用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行定量多聚酶链反应,在 95 ℃,1 min,1 个循环;95 ℃,5 s,40 个循环;60 ℃,30 s,40 个循环的条件下对反应液进行 Real-time PCR 扩增(Bio-Rad CFX96 荧光定量 PCR 仪,美国),测定 A549 和 A549/DDP 细胞间 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因表达水平;不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)刺激细胞 4 h 后,分别提取两株细胞 RNA 检测 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平变化。
1.2.2 Western blot 实验 A549、A549/DDP 细胞培养后抽提总蛋白,BCA 法测定总蛋白浓度,配胶后进行 SDS-PAGE 电泳,转膜并封闭,分别于 4 ℃ 孵育不同抗体和内参抗体过夜,TBST 分别洗涤膜 3 次后再孵育相应的二抗后,再用 TBST 洗涤膜 3 次,将 PVDF 膜正面向上铺于成像仪,用 Bio-Rad ChemiDoc MP 凝胶成像分析系统成像显影,蛋白谱带强度使用 ImageJ 软件分析。
1.2.3 细胞增殖实验(CCK-8)及凋亡检测 分别制备 A549 细胞和 A549/DDP 细胞悬液后接种 96 孔板,细胞密度为 1×104/孔,予二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)共培养 24 h,48 h 和 72 h 后,每孔加入 10 µl CCK8 孵育 4 h,用 flexstation 3 酶标仪(美国加利福尼亚 Molecular Devices 公司)在 450 nm 波长处测量并记录每孔中的吸光度;分别将 A549、A549/DDP 细胞接种于 24 孔板中,细胞密度为 5×104/ml,经不同浓度二甲双胍作用 24 h 或 48 h 后,胰酶消化收集细胞,重悬于 binding buffer 中,加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl propidium iodide(PI),室温避光 20 min,上机用流式细胞仪 BD FACSAriaTM II flow cytometer(美国加利福尼亚 BD biosciences 公司)检测细胞凋亡率。
1.3 统计学方法
数据均用均数±标准差( )表示,所得实验数据采用 SPSS 13.0 统计软件包进行数据处理。两样本均数之间的比较采用 t 检验,多个样本均数之间的比较采用单因素方差分析,计量资料使用 χ2 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A549 与 A549/DDP 细胞株间各耐药基因的基因和蛋白表达差异
经 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因水平筛选,对 A549 与 A549/DDP 细胞株进行基因表达检测,结果显示 A549 与 A549/DDP 细胞株的 Nrf2、MRP-1、GST 在基因水平的表达有明显差异,且在 A549/DDP 细胞株中的表达水平比 A549 显著增高(图 1a、1b、1c)。通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证,发现结果与基因水平筛选一致(图 1d)。以上结果提示,Nrf2、MRP-1、GST 在肺腺癌 DDP 耐药细胞株中的表达水平比敏感株显著增高。

2.2 不同浓度二甲双胍对 A549、A549/DDP 细胞增殖抑制及凋亡的影响
对 A549 与 A549/DDP 细胞株均予以不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)刺激,进行细胞增殖实验及凋亡检测,结果见图 2。随着二甲双胍浓度增高,A549 细胞增殖能力逐步减弱,尤其浓度为 5 mmol/L和 10 mmol/L 时,增殖能力明显减弱(图 2a);当二甲双胍浓度为 10 mmol/L 时,A549/DDP 细胞增殖能力明显减弱(图 2b)。且当二甲双胍浓度为 5 mmol/L 和 10 mmol/L 时,A549 细胞 48 h 后凋亡率(图 2e)较 24 h 凋亡率(图 2c)明显升高,但相同条件下 A549/DDP 细胞(图 2d、2f)凋亡率在 48 h 时较 24 h 仅轻度升高(均 P<0.05),提示二甲双胍诱导耐药细胞的凋亡率明显低于非耐药细胞,且作用的最佳时间点是 48 h。

2.3 二甲双胍刺激后各下游基因的变化
为了进一步明确二甲双胍刺激后各耐药基因的变化情况,用不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)刺激 A549 和 A549/DDP 细胞株,4 h 后提取 RNA 检测各基因水平变化,并通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证,发现随着二甲双胍浓度增高,A549 细胞(图 3)和 A549/DDP 细胞株(图 4)的 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平和蛋白水平的表达均逐步降低,提示二甲双胍能够明显抑制各耐药基因的表达。

3 讨论
本研究发现人肺腺癌 A549、A549/DDP 细胞 Nrf2 及下游抗氧化基因 GST、MRP-1 蛋白水平比较,差异存在统计学意义(P均<0.01)。Nrf2 可以在 Nrf2 诱导剂刺激下,通过与 MRP-2 基因明确的 ARE 位点结合,提高 MRP-2 的表达[25]。而 MRP-1 可以将 GSH 与抗癌药物形成 GSH 复合物泵出胞外[26-28],阻碍细胞内抗癌药物与靶位点结合降低细胞内抗癌药物浓度,致肿瘤细胞产生耐药性[29-30]。下调耐 DDP 的人肺腺癌细胞的 MRP 表达后,其对 DDP 的耐药性显著降低[31]。GSH 可能促进 DNA 的修复低[29],并可与铂或铂-DNA 络合物结合,降低顺铂的毒性,促进肿瘤细胞解毒。应用 GST 抑制剂可以增强 DDP 对耐药细胞株的细胞毒作用[32]。GSTs 属于 Ⅱ 相共轭酶,它们能将有活性的亲电子代谢产物解毒,它们的效应依赖于谷胱甘肽的水平,后者取决于 GCL 和 GSH 合酶[33]。
二甲双胍可能主要通过抑制线粒体呼吸链复合物 Ⅰ,小分子干扰 RNA 抑制 AMPK 的表达后,可逆转二甲双胍的抗肿瘤增殖作用[34-35]。本研究发现,二甲双胍能抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖,促进其凋亡,并呈时间和浓度依赖性,但对 A549/DDP 细胞,仅在高浓度二甲双胍时方能显示其对细胞增殖的抑制作用。经二甲双胍刺激,A549、A549/DDP 细胞 GST、Mrp-1、Nrf2 基因的 mRNA、蛋白水平表达存在显著差异(均P<0.05),我们研究进一步印证了二甲双胍的抗肿瘤效应。