肺腺癌对铂类耐药是影响预后的主要问题，Keap1/Nrf2/ARE 信号通路在铂类耐药中发挥重要作用[1]。在活性氧的刺激下，转录因子 Nrf2[2]与 Keap1 解偶联，Nrf2 入核结合于肌腱纤维瘤蛋白（sMaf）形成异二聚体后启动 ARE 靶基因转录[3]，启动超氧化物歧化酶（SOD）、血红素氧化酶-1（HO-1）、谷胱甘肽转移酶（GSH）等 Ⅱ 相解毒酶[4]转录，提高细胞抗氧化应激能力[5]，增强肿瘤细胞的代谢活动和生长，促进肿瘤增殖[6]；导致癌细胞凋亡减少，使肿瘤耐药作用加强[7-9]，多药耐药相关蛋白 1（MRP-1）在多药耐药性（MDR）中发挥了非常重要的作用[10-11]，MRPs 常与 Ⅱ 相解毒酶表达的调控具有协同作用[12-14]。Nrf2 活性受 MAPKs 信号通路的调控[15-16]，但 MAPKs 直接磷酸化 Nrf2，并不引起显著的 Nrf2 激活，且因不同肿瘤细胞而不同，Nrf2 活化入核与磷酸化的 ERK、JNK、p38 形成二聚体，再激活 Nrf2 下游基因的转录[17]；不同机体脏器部位 Nrf2 基因激活的途径亦不同[18]。二甲双胍能降低糖尿病患者合并卵巢癌、肺癌、肝癌等肿瘤风险[19-20]；可通过调控细胞周期蛋白及其相关因子的表达，阻滞不同肿瘤细胞于细胞 G 0/G 1 期或 G 1/S 期[21-23]；亦可抑制不同病理类型的肺癌细胞增殖[24]，并呈剂量依赖性，仅在小细胞癌细胞系中具有诱导细胞凋亡的作用。目前国内外对二甲双胍影响耐铂类肺腺癌细胞中 Nrf2 基因表达的机制鲜有报道。本研究观察 Nrf2/ARE 信号通路在肺腺癌铂类耐药表达中的作用，旨在源头上寻找多药耐药过程中的关键基因，为肿瘤的临床精准化疗提供理论依据和治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株及试剂 人肺腺癌细胞株 A549、耐顺铂（DDP）肺腺癌细胞株 A549/DDP（中国科学院上海生命科学院细胞库）；RPMI1640 干粉培养基（Gibco 公司）；胎牛血清（FBS）为 Hyclon 产品（上海鲁汶生物工程）；RNA 反转录采用 PrimeScript RTreagent Kit RR047A 试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒采用 SYBR PrimeScript（Perfect Real Time）RR086A 试剂盒（大连 TakaRa 公司），二甲双胍（上海生工生物工程股份有限公司）；所用引物（表 1；上海博彩生物科技有限公司）。
表1
研究中所用引物序列
1.1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞培养于 10% FBS RPMI1640 中，含青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 mg/ml），在 5% CO 2、37 ℃ 饱和湿度的培养箱内培养。
1.2 方法
1.2.1 基因表达检测 A549 和 A549/DDP 细胞接种于 6 孔板中，以 1×105/孔的密度培养 24 h 后收集细胞，根据说明书推荐的方法用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，再转录成 cDNA，用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行定量多聚酶链反应，在 95 ℃，1 min，1 个循环；95 ℃，5 s，40 个循环；60 ℃，30 s，40 个循环的条件下对反应液进行 Real-time PCR 扩增（Bio-Rad CFX96 荧光定量 PCR 仪，美国），测定 A549 和 A549/DDP 细胞间 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因表达水平；不同浓度二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）刺激细胞 4 h 后，分别提取两株细胞 RNA 检测 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平变化。
1.2.2 Western blot 实验 A549、A549/DDP 细胞培养后抽提总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度，配胶后进行 SDS-PAGE 电泳，转膜并封闭，分别于 4 ℃ 孵育不同抗体和内参抗体过夜，TBST 分别洗涤膜 3 次后再孵育相应的二抗后，再用 TBST 洗涤膜 3 次，将 PVDF 膜正面向上铺于成像仪，用 Bio-Rad ChemiDoc MP 凝胶成像分析系统成像显影，蛋白谱带强度使用 ImageJ 软件分析。
1.2.3 细胞增殖实验（CCK-8）及凋亡检测 分别制备 A549 细胞和 A549/DDP 细胞悬液后接种 96 孔板，细胞密度为 1×104/孔，予二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）共培养 24 h，48 h 和 72 h 后，每孔加入 10 µl CCK8 孵育 4 h，用 flexstation 3 酶标仪（美国加利福尼亚 Molecular Devices 公司）在 450 nm 波长处测量并记录每孔中的吸光度；分别将 A549、A549/DDP 细胞接种于 24 孔板中，细胞密度为 5×104/ml，经不同浓度二甲双胍作用 24 h 或 48 h 后，胰酶消化收集细胞，重悬于 binding buffer 中，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl propidium iodide（PI），室温避光 20 min，上机用流式细胞仪 BD FACSAriaTM II flow cytometer（美国加利福尼亚 BD biosciences 公司）检测细胞凋亡率。
1.3 统计学方法
数据均用均数±标准差（ ）表示，所得实验数据采用 SPSS 13.0 统计软件包进行数据处理。两样本均数之间的比较采用 t 检验，多个样本均数之间的比较采用单因素方差分析，计量资料使用 χ2 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A549 与 A549/DDP 细胞株间各耐药基因的基因和蛋白表达差异
经 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因水平筛选，对 A549 与 A549/DDP 细胞株进行基因表达检测，结果显示 A549 与 A549/DDP 细胞株的 Nrf2、MRP-1、GST 在基因水平的表达有明显差异，且在 A549/DDP 细胞株中的表达水平比 A549 显著增高（图 1a、1b、1c）。通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证，发现结果与基因水平筛选一致（图 1d）。以上结果提示，Nrf2、MRP-1、GST 在肺腺癌 DDP 耐药细胞株中的表达水平比敏感株显著增高。
图1
A549 与 A549/DDP 细胞株中耐药基因 mRNA 和蛋白表达 a. Nrf2 Real-time PCR 检测结果；b. MRP-1 Real-time PCR 检测结果；c. GST Real-time PCR 检测结果；d. 耐药基因 Western Blot 法检测结果。**与对照组比较 P<0.05，*与对照组比较 P<0.01
2.2 不同浓度二甲双胍对 A549、A549/DDP 细胞增殖抑制及凋亡的影响
对 A549 与 A549/DDP 细胞株均予以不同浓度二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）刺激，进行细胞增殖实验及凋亡检测，结果见图 2。随着二甲双胍浓度增高，A549 细胞增殖能力逐步减弱，尤其浓度为 5 mmol/L和 10 mmol/L 时，增殖能力明显减弱（图 2a）；当二甲双胍浓度为 10 mmol/L 时，A549/DDP 细胞增殖能力明显减弱（图 2b）。且当二甲双胍浓度为 5 mmol/L 和 10 mmol/L 时，A549 细胞 48 h 后凋亡率（图 2e）较 24 h 凋亡率（图 2c）明显升高，但相同条件下 A549/DDP 细胞（图 2d、2f）凋亡率在 48 h 时较 24 h 仅轻度升高（均 P<0.05），提示二甲双胍诱导耐药细胞的凋亡率明显低于非耐药细胞，且作用的最佳时间点是 48 h。
图2
二甲双胍对 A549、A549/DDP 细胞增殖及凋亡的影响 a. 二甲双胍对 A549 细胞增殖的影响；b. 二甲双胍对 A549/DDP 细胞增殖的影响；c. 二甲双胍对 A549 细胞 24 h 凋亡率的影响；d. 二甲双胍对 A549/DDP 细胞 24 h 凋亡率的影响；e. 二甲双胍对 A549 细胞 48 h 凋亡率的影响；f. 二甲双胍对 A549/DDP 细胞 48 h 凋亡率的影响。当二甲双胍浓度为 5 mmol/L 和 10 mmol/L 时，A549 细胞增殖能力明显减弱（P<0.01）；当二甲双胍浓度为 10 mmol/L 时，A549/DDP 细胞增殖能力明显减弱（P<0.01）。在 5、10 mmol/L 二甲双胍作用下，A549 细胞 48 h 凋亡率较 24 h 凋亡率明显升高（P<0.01），而 A549/DDP 细胞凋亡率仅在 10 mmol/L 二甲双胍作用 48 h 后轻度升高（P<0.05）
2.3 二甲双胍刺激后各下游基因的变化
为了进一步明确二甲双胍刺激后各耐药基因的变化情况，用不同浓度二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）刺激 A549 和 A549/DDP 细胞株，4 h 后提取 RNA 检测各基因水平变化，并通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证，发现随着二甲双胍浓度增高，A549 细胞（图 3）和 A549/DDP 细胞株（图 4）的 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平和蛋白水平的表达均逐步降低，提示二甲双胍能够明显抑制各耐药基因的表达。
图3
二甲双胍对 A549 细胞的 Nrf2、GST 和 Mrp-1 基因 mRNA 和蛋白水平的影响 a. Nrf2 Real-time PCR 检测结果；b. GST Real-time PCR 检测结果；c. MRP-1 Real-time PCR 检测结果；d. 耐药基因 Western blot 法检测结果。在二甲双胍 5、10 mmol/L 时，耐药基因 mRNA 水平和蛋白水平的表达均显著下降（P<0.01）
3 讨论
本研究发现人肺腺癌 A549、A549/DDP 细胞 Nrf2 及下游抗氧化基因 GST、MRP-1 蛋白水平比较，差异存在统计学意义（P均<0.01）。Nrf2 可以在 Nrf2 诱导剂刺激下，通过与 MRP-2 基因明确的 ARE 位点结合，提高 MRP-2 的表达[25]。而 MRP-1 可以将 GSH 与抗癌药物形成 GSH 复合物泵出胞外[26-28]，阻碍细胞内抗癌药物与靶位点结合降低细胞内抗癌药物浓度，致肿瘤细胞产生耐药性[29-30]。下调耐 DDP 的人肺腺癌细胞的 MRP 表达后，其对 DDP 的耐药性显著降低[31]。GSH 可能促进 DNA 的修复低[29]，并可与铂或铂-DNA 络合物结合，降低顺铂的毒性，促进肿瘤细胞解毒。应用 GST 抑制剂可以增强 DDP 对耐药细胞株的细胞毒作用[32]。GSTs 属于 Ⅱ 相共轭酶，它们能将有活性的亲电子代谢产物解毒，它们的效应依赖于谷胱甘肽的水平，后者取决于 GCL 和 GSH 合酶[33]。
二甲双胍可能主要通过抑制线粒体呼吸链复合物 Ⅰ，小分子干扰 RNA 抑制 AMPK 的表达后，可逆转二甲双胍的抗肿瘤增殖作用[34-35]。本研究发现，二甲双胍能抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖，促进其凋亡，并呈时间和浓度依赖性，但对 A549/DDP 细胞，仅在高浓度二甲双胍时方能显示其对细胞增殖的抑制作用。经二甲双胍刺激，A549、A549/DDP 细胞 GST、Mrp-1、Nrf2 基因的 mRNA、蛋白水平表达存在显著差异（均P<0.05），我们研究进一步印证了二甲双胍的抗肿瘤效应。
肺腺癌对铂类耐药是影响预后的主要问题，Keap1/Nrf2/ARE 信号通路在铂类耐药中发挥重要作用[1]。在活性氧的刺激下，转录因子 Nrf2[2]与 Keap1 解偶联，Nrf2 入核结合于肌腱纤维瘤蛋白（sMaf）形成异二聚体后启动 ARE 靶基因转录[3]，启动超氧化物歧化酶（SOD）、血红素氧化酶-1（HO-1）、谷胱甘肽转移酶（GSH）等 Ⅱ 相解毒酶[4]转录，提高细胞抗氧化应激能力[5]，增强肿瘤细胞的代谢活动和生长，促进肿瘤增殖[6]；导致癌细胞凋亡减少，使肿瘤耐药作用加强[7-9]，多药耐药相关蛋白 1（MRP-1）在多药耐药性（MDR）中发挥了非常重要的作用[10-11]，MRPs 常与 Ⅱ 相解毒酶表达的调控具有协同作用[12-14]。Nrf2 活性受 MAPKs 信号通路的调控[15-16]，但 MAPKs 直接磷酸化 Nrf2，并不引起显著的 Nrf2 激活，且因不同肿瘤细胞而不同，Nrf2 活化入核与磷酸化的 ERK、JNK、p38 形成二聚体，再激活 Nrf2 下游基因的转录[17]；不同机体脏器部位 Nrf2 基因激活的途径亦不同[18]。二甲双胍能降低糖尿病患者合并卵巢癌、肺癌、肝癌等肿瘤风险[19-20]；可通过调控细胞周期蛋白及其相关因子的表达，阻滞不同肿瘤细胞于细胞 G 0/G 1 期或 G 1/S 期[21-23]；亦可抑制不同病理类型的肺癌细胞增殖[24]，并呈剂量依赖性，仅在小细胞癌细胞系中具有诱导细胞凋亡的作用。目前国内外对二甲双胍影响耐铂类肺腺癌细胞中 Nrf2 基因表达的机制鲜有报道。本研究观察 Nrf2/ARE 信号通路在肺腺癌铂类耐药表达中的作用，旨在源头上寻找多药耐药过程中的关键基因，为肿瘤的临床精准化疗提供理论依据和治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株及试剂 人肺腺癌细胞株 A549、耐顺铂（DDP）肺腺癌细胞株 A549/DDP（中国科学院上海生命科学院细胞库）；RPMI1640 干粉培养基（Gibco 公司）；胎牛血清（FBS）为 Hyclon 产品（上海鲁汶生物工程）；RNA 反转录采用 PrimeScript RTreagent Kit RR047A 试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒采用 SYBR PrimeScript（Perfect Real Time）RR086A 试剂盒（大连 TakaRa 公司），二甲双胍（上海生工生物工程股份有限公司）；所用引物（表 1；上海博彩生物科技有限公司）。
表1
研究中所用引物序列
1.1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞培养于 10% FBS RPMI1640 中，含青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 mg/ml），在 5% CO 2、37 ℃ 饱和湿度的培养箱内培养。
1.2 方法
1.2.1 基因表达检测 A549 和 A549/DDP 细胞接种于 6 孔板中，以 1×105/孔的密度培养 24 h 后收集细胞，根据说明书推荐的方法用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，再转录成 cDNA，用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行定量多聚酶链反应，在 95 ℃，1 min，1 个循环；95 ℃，5 s，40 个循环；60 ℃，30 s，40 个循环的条件下对反应液进行 Real-time PCR 扩增（Bio-Rad CFX96 荧光定量 PCR 仪，美国），测定 A549 和 A549/DDP 细胞间 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因表达水平；不同浓度二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）刺激细胞 4 h 后，分别提取两株细胞 RNA 检测 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平变化。
1.2.2 Western blot 实验 A549、A549/DDP 细胞培养后抽提总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度，配胶后进行 SDS-PAGE 电泳，转膜并封闭，分别于 4 ℃ 孵育不同抗体和内参抗体过夜，TBST 分别洗涤膜 3 次后再孵育相应的二抗后，再用 TBST 洗涤膜 3 次，将 PVDF 膜正面向上铺于成像仪，用 Bio-Rad ChemiDoc MP 凝胶成像分析系统成像显影，蛋白谱带强度使用 ImageJ 软件分析。
1.2.3 细胞增殖实验（CCK-8）及凋亡检测 分别制备 A549 细胞和 A549/DDP 细胞悬液后接种 96 孔板，细胞密度为 1×104/孔，予二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）共培养 24 h，48 h 和 72 h 后，每孔加入 10 µl CCK8 孵育 4 h，用 flexstation 3 酶标仪（美国加利福尼亚 Molecular Devices 公司）在 450 nm 波长处测量并记录每孔中的吸光度；分别将 A549、A549/DDP 细胞接种于 24 孔板中，细胞密度为 5×104/ml，经不同浓度二甲双胍作用 24 h 或 48 h 后，胰酶消化收集细胞，重悬于 binding buffer 中，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl propidium iodide（PI），室温避光 20 min，上机用流式细胞仪 BD FACSAriaTM II flow cytometer（美国加利福尼亚 BD biosciences 公司）检测细胞凋亡率。
1.3 统计学方法
数据均用均数±标准差（ ）表示，所得实验数据采用 SPSS 13.0 统计软件包进行数据处理。两样本均数之间的比较采用 t 检验，多个样本均数之间的比较采用单因素方差分析，计量资料使用 χ2 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A549 与 A549/DDP 细胞株间各耐药基因的基因和蛋白表达差异
经 GST、HO-1、MRP-1、Nrf2、SOD 基因水平筛选，对 A549 与 A549/DDP 细胞株进行基因表达检测，结果显示 A549 与 A549/DDP 细胞株的 Nrf2、MRP-1、GST 在基因水平的表达有明显差异，且在 A549/DDP 细胞株中的表达水平比 A549 显著增高（图 1a、1b、1c）。通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证，发现结果与基因水平筛选一致（图 1d）。以上结果提示，Nrf2、MRP-1、GST 在肺腺癌 DDP 耐药细胞株中的表达水平比敏感株显著增高。
图1
A549 与 A549/DDP 细胞株中耐药基因 mRNA 和蛋白表达 a. Nrf2 Real-time PCR 检测结果；b. MRP-1 Real-time PCR 检测结果；c. GST Real-time PCR 检测结果；d. 耐药基因 Western Blot 法检测结果。**与对照组比较 P<0.05，*与对照组比较 P<0.01
2.2 不同浓度二甲双胍对 A549、A549/DDP 细胞增殖抑制及凋亡的影响
对 A549 与 A549/DDP 细胞株均予以不同浓度二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）刺激，进行细胞增殖实验及凋亡检测，结果见图 2。随着二甲双胍浓度增高，A549 细胞增殖能力逐步减弱，尤其浓度为 5 mmol/L和 10 mmol/L 时，增殖能力明显减弱（图 2a）；当二甲双胍浓度为 10 mmol/L 时，A549/DDP 细胞增殖能力明显减弱（图 2b）。且当二甲双胍浓度为 5 mmol/L 和 10 mmol/L 时，A549 细胞 48 h 后凋亡率（图 2e）较 24 h 凋亡率（图 2c）明显升高，但相同条件下 A549/DDP 细胞（图 2d、2f）凋亡率在 48 h 时较 24 h 仅轻度升高（均 P<0.05），提示二甲双胍诱导耐药细胞的凋亡率明显低于非耐药细胞，且作用的最佳时间点是 48 h。
图2
二甲双胍对 A549、A549/DDP 细胞增殖及凋亡的影响 a. 二甲双胍对 A549 细胞增殖的影响；b. 二甲双胍对 A549/DDP 细胞增殖的影响；c. 二甲双胍对 A549 细胞 24 h 凋亡率的影响；d. 二甲双胍对 A549/DDP 细胞 24 h 凋亡率的影响；e. 二甲双胍对 A549 细胞 48 h 凋亡率的影响；f. 二甲双胍对 A549/DDP 细胞 48 h 凋亡率的影响。当二甲双胍浓度为 5 mmol/L 和 10 mmol/L 时，A549 细胞增殖能力明显减弱（P<0.01）；当二甲双胍浓度为 10 mmol/L 时，A549/DDP 细胞增殖能力明显减弱（P<0.01）。在 5、10 mmol/L 二甲双胍作用下，A549 细胞 48 h 凋亡率较 24 h 凋亡率明显升高（P<0.01），而 A549/DDP 细胞凋亡率仅在 10 mmol/L 二甲双胍作用 48 h 后轻度升高（P<0.05）
2.3 二甲双胍刺激后各下游基因的变化
为了进一步明确二甲双胍刺激后各耐药基因的变化情况，用不同浓度二甲双胍（0、1、5、10 mmol/L）刺激 A549 和 A549/DDP 细胞株，4 h 后提取 RNA 检测各基因水平变化，并通过 Western Blot 实验进行蛋白水平验证，发现随着二甲双胍浓度增高，A549 细胞（图 3）和 A549/DDP 细胞株（图 4）的 Nrf2、GST 和 MRP-1 基因水平和蛋白水平的表达均逐步降低，提示二甲双胍能够明显抑制各耐药基因的表达。
图3
二甲双胍对 A549 细胞的 Nrf2、GST 和 Mrp-1 基因 mRNA 和蛋白水平的影响 a. Nrf2 Real-time PCR 检测结果；b. GST Real-time PCR 检测结果；c. MRP-1 Real-time PCR 检测结果；d. 耐药基因 Western blot 法检测结果。在二甲双胍 5、10 mmol/L 时，耐药基因 mRNA 水平和蛋白水平的表达均显著下降（P<0.01）
3 讨论
本研究发现人肺腺癌 A549、A549/DDP 细胞 Nrf2 及下游抗氧化基因 GST、MRP-1 蛋白水平比较，差异存在统计学意义（P均<0.01）。Nrf2 可以在 Nrf2 诱导剂刺激下，通过与 MRP-2 基因明确的 ARE 位点结合，提高 MRP-2 的表达[25]。而 MRP-1 可以将 GSH 与抗癌药物形成 GSH 复合物泵出胞外[26-28]，阻碍细胞内抗癌药物与靶位点结合降低细胞内抗癌药物浓度，致肿瘤细胞产生耐药性[29-30]。下调耐 DDP 的人肺腺癌细胞的 MRP 表达后，其对 DDP 的耐药性显著降低[31]。GSH 可能促进 DNA 的修复低[29]，并可与铂或铂-DNA 络合物结合，降低顺铂的毒性，促进肿瘤细胞解毒。应用 GST 抑制剂可以增强 DDP 对耐药细胞株的细胞毒作用[32]。GSTs 属于 Ⅱ 相共轭酶，它们能将有活性的亲电子代谢产物解毒，它们的效应依赖于谷胱甘肽的水平，后者取决于 GCL 和 GSH 合酶[33]。
二甲双胍可能主要通过抑制线粒体呼吸链复合物 Ⅰ，小分子干扰 RNA 抑制 AMPK 的表达后，可逆转二甲双胍的抗肿瘤增殖作用[34-35]。本研究发现，二甲双胍能抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖，促进其凋亡，并呈时间和浓度依赖性，但对 A549/DDP 细胞，仅在高浓度二甲双胍时方能显示其对细胞增殖的抑制作用。经二甲双胍刺激，A549、A549/DDP 细胞 GST、Mrp-1、Nrf2 基因的 mRNA、蛋白水平表达存在显著差异（均P<0.05），我们研究进一步印证了二甲双胍的抗肿瘤效应。
